Editatu da Peter Sarnow, Stanford University School of Medicine, Stanford University, California, appruvatu u 25 dicembre 2020 (revisatu u 25 ottobre 2020)
Riportamu l'interazzione trà e subunità in a replicazione di i cumplessi di trascrizione di coronavirus, chì sò essenziali per a replicazione è a cunservazione evolutiva.Avemu furnitu evidenza chì u duminiu NiRAN assuciatu à nsp12 hà attività di transferasi di nucleosidi monofosfatu (NMP) in trans, è identificatu nsp9 (una proteina di legame RNA) cum'è u so mira.NiRAN catalizza l'attaccamentu covalente di a frazione NMP à u terminus amminicu nsp9 cunservatu in una reazione chì si basa nantu à ioni Mn2 + è residui Asn conservati adiacenti.Hè statu trovu chì l'attività NiRAN è nsp9 NMPylation sò essenziali per a replicazione di coronavirus.I dati ci permettenu di ligà sta attività di u marcatore di l'enzima di virus nidificatu à l'osservazioni precedenti in l'ipotesi chì l'iniziu di a sintesi di RNA in una classe di virus RNA hè funziunale è evolutivamente coherente.
L'RNA polimerasi dipendente da l'RNA (RdRps) di Nidovirales (Coronaviridae, Arterioviridae è altre 12 famiglie) hè ligata à u duminiu amino-terminale (N-terminale) in a proteina non strutturale (nsp) liberata da a poliproteina, chjamata NiRAN. 1ab hè cumpostu di proteasi principale virali (Mpro).In precedenza, l'attività di GMPylation / UMPylation di u virus arteriale NiRAN-RdRp nsp hè stata rappurtata, è hè statu suggeritu di generà un transitorio per u trasferimentu di monofosfatu di nucleosidi (NMP) à u virus (attualmente scunnisciutu) è / o cose di biopolimerizazione cellulare.Quì, mostriamu chì u coronavirus (Coronavirus Umanu [HCoV] -229E è Sindrome Respiratoriu Acutu Severu Coronavirus 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) hà attività di NMPylation dipendente da Mn2+, chì hè derivata da nsp9 per via di a furmazione di nsp9 mediata da Mpro. l'nsps flanking N-terminale hè liberatu proteoliticamente, u phosphoramidate hè ligatu à l'amina primaria (N3825) à l'N-terminale di nsp9.L'uridine trifosfatu hè u nucleotide preferitu in questa reazione, ma l'adenosine trifosfatu, u guanosina trifosfatu è u cytidine triphosphate sò ancu co-substrati adattati.Studi di mutazione chì utilizanu proteine nsp9 è nsp12 ricombinanti di coronavirus è mutanti HCoV-229E geneticamente modificati determinanu i residui necessarii per a NMPylation nsp9 mediata da NiRAN è a replicazione di virus in cultura cellulare.I dati anu cunfirmatu a prediczione di i residui di u situ attivu NiRAN è determinatu u rolu impurtante di i residui nsp9 N3826 in nsp9 NMPylation è a replicazione di virus in vitro.Stu residuu hè parte di a sequenza tripeptide NNE N-terminale cunservata è hè statu dimustratu esse l'unicu residuu invariante di nsp9 è i so omologhi in a famiglia di coronavirus.Stu studiu furnisce un fundamentu solidu per u studiu funziunale di l'attività di NMPylation di altri virus nidificatu è prupone pussibuli miri per u sviluppu di droghe antivirali.
U virus Nidovirales RNA pusitivu infetta una varietà di vertebrati è invertebrati (1, 2).L'ordine include attualmente 14 famiglie (3), di e quali a famiglia di Coronavirus hè stata studiata largamente in l'ultimi 20 anni.À quellu tempu, trè coronavirus zoonotichi sò emersi da l'ospiti di l'animali è anu causatu epidemie à grande scala di infezioni respiratorie severi in l'omu.Incluse pandemie persistenti causate da malatie infettive acute gravi.Sindrome Respiratoriu Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) (4âââ7).I nidovirus sparte una urganizazione genomica cumuna, è a subunità di u cumplessu di replicazione-trascrizzione ligata à a membrana (RTC) hè codificata in i dui terzi 5-?²-terminali è a subunità strutturale principale di a particella di virus, è ancu in certi accessori. .Prutiina, codificata in u terzu di u genoma (1).Eccettu per una famiglia di virus planari (Monoviridae) (8), tutti i virus annidati codificanu subunità RTC in dui grandi cornici di lettura aperta (ORF) ORF1a è ORF1b, chì sò tradotti da l'RNA genomicu di.ORF1a codifica a poliproteina (pp) 1a, è ORF1a è ORF1b codificanu inseme pp1ab.Cù a participazione generale di a proteasi principale (Mpro) codificata da ORF1a, sia pp1a sia pp1ab sò processati proteoliticamente in una varietà di proteine non strutturali (nsps), cunnisciute ancu com'è 3CLpro, perchè anu omologia cù u 3Cpro di u picornavirus ( 9).Questi nsps sò pensati per esse assemblati in un grande RTC dinamica, catalizanu a sintesi di l'RNA genomicu (replicazione) è un inseme di RNA subgenomicu (trascrizzione), è sò usati per coordinà l'espressione di l'ORF situata a valle di ORF1b (10?? ? 12).
U core RTC include RNA polimerasi dipendente da RNA (RdRp) (13), superfamiglia 1 helicase (HEL1) (14, 15) è parechji enzimi di trasfurmazioni di RNA, chì sò principalmente codificati in ORF1b è in a famiglia di coronavirus Contene nsp12-nsp16 è nsp9-nsp12 in a famiglia Arterioviridae (vede riferimentu 10ââ 12).RdRp è HEL1 rapprisentanu dui (una quinta) domini cunservati di u virus di u nidu di l'uccelli è anu omologia trà altri virus RNA.Core replicase hè credutu chì hè assistitu da altre subunità, cumpresi parechji picculi nsps liberati da a regione carboxy-terminale (C-terminale) di pp1a, downstream di Mpro (coronavirus nsp5 è arteria virus nsp4, rispettivamente).Hanu una prutezzione limitata di a famiglia specifica è diverse attività (rivisu in riferimentu 10ââ12).
Relativamente recentemente, un duminiu cù caratteristiche di motivi di sequenza unicu hè statu trovu à l'amino terminus (N-terminale) adiacente à RdRp in tutti i virus annidati, ma micca altri virus RNA (16).Basatu nantu à a so situazione è l'attività di nucleotide transferase (nucleoside monophosphate [NMP] transferase), stu duminiu hè chjamatu NiRAN (Nestvirus RdRp-related nucleotide transferase).A cumminazione di duplice duminiu di NiRAN-RdRp custituisce nsp12 in a famiglia Coronaviridae è nsp9 in a famiglia di Arterioviridae, è in altri nestoviridae, NiRAN-RdRp hè prevista per esse liberatu cum'è nsp indipendente da a poliproteina virali.In u coronavirus, u duminiu NiRAN cuntene residui ??1/450 è hè cunnessu à u duminiu RdRp C-terminale attraversu a regione linker (16-19).In Equine Arteritis Virus (EAV) (Arteriviridae), nsp9 recombinante mostra attività di UMPylation (auto) Mn2+ dipendente da ioni è GMPylation, chì dipendenu da trè basi di sequenza conservata in nestovirus, AN, BN è CN I residui in a sequenza.Induve N sta per NiRAN) (16).U flanking N-terminale di sti mutivi hè un mutivu menu cunservatore preAN.Alcuni di questi residui sò ancu cunservati in protein kinases distanti, induve sò stati dimustrati per esse implicati in l'attività di ubligazione di nucleoside triphosphate (NTP) è catalitica (20, 21).In cunfurmità cù questa osservazione, parechji residui di siti attivi chjave in a pseudokinase SelO da Pseudomonas syringae ponu esse assemblati cù u supercomplexu SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 recentemente publicatu.I residui di Coronavirus NiRAN conservati sovrapposti in a microstruttura elettronica.Proteina recombinante (17).Hè speculatu chì u documentatu (auto) U / GMPylation pruducerà un statu transitorio per trasferisce NMP à u sustrato (attualmente scunnisciutu) (16), è a somiglianza strutturale trà NiRAN è protein kinase (17, 19) ) Hè l'ipotesi chì NiRAN modifica altre proteine.
Parechje caratteristiche, cumpresa a so associazione sistematica unica è unica cù virus nidificatu è separazione genetica da RdRp, facenu NiRAN un enzima regulatore chjave ragiunate per i virus nidificati, chì hè criticu per a so emergenza è identità.Prima, trè funzioni pussibuli chì implicanu NiRAN per regulà a traduzzione di genoma / subgenomica o replicazione / trascrizione sò state chjamate.Quandu si cunsiderà i dati scarsi è incompleti dispunibuli à u mumentu, ogni funzione hà i so vantaghji è disadvantages (16).In questa ricerca, avemu u scopu di cumminà i studii biochimici è genetichi inversi di i coronavirus chì rapprisentanu i dui generi, è mette i nostri risultati in u sfondate evolutivu di a mutazione naturale di a famiglia di coronavirus, per avè una visione di stu regnu misteriosu.Riportamu avanzati maiò in a cunniscenza di NiRAN attraversu l'identificazione di miri naturali in RTC, chì (trà e trè ipotesi dispunibuli) cuntribuisci à u rolu di stu duminiu in l'iniziu di a sintesi di l'RNA di virus nidificatu.Sta ricerca apre ancu pussibulità per altri roli di NiRAN nantu à l'interfaccia di l'ospite di virus.
Per caratterizà e proprietà enzimatiche di u duminiu NiRAN in relazione à u virus corona nsp12, avemu pruduttu una forma recombinante di coronavirus umanu 229E (HCoV-229E) nsp12 in E. coli, cù un tag His6 à u C-terminale, è cumminatu u proteina cù [α32-P] Incubare inseme cù NTP in presenza di MnCl2 cum'è descritta in Materiali è Methodi.L'analisi di u pruduttu di reazione hà indicatu a presenza di una proteina radiomarcata co-migrazione cù nsp12 (106 kDa), chì indica chì u coronavirus nsp12 catalizza a furmazione di addutti covalenti di proteina-NMP, formati preferibilmente cù uridine monofosfatu (UMP) (Figura 1A) È B).L'analisi quantitativa hà dimustratu chì, cumparatu cù altri nucleotidi, l'intensità di u signale di l'incorporazione UMP aumentava da 2 à 3 volte (Figura 1C).Questa dati hè coherente cù l'attività di transferasi NMP prevista di u duminiu NiRAN di u coronavirus (16), ma indica chì e preferenze di nucleotidi di u duminiu NiRAN di u coronavirus è u virus arteriale sò sfarenti.
Attività di auto-NMPylation di HCoV-229E nsp12.(A) HCoV-229E nsp12-His6 (106 kDa) hè stata incubata cù u [α-32P] NTP designatu in presenza di 6 mM MnCl2 per 30 minuti (vede Materiali è Metodi per i dettagli).I prudutti di reazzione sò stati separati da SDS-PAGE è macchiati cù Coomassie brillanti blu.(B) A proteina radiomarcata hè visualizata da l'imaghjini di fosforu.I pusizioni di nsp12-His6 è i marcatori di massa moleculare di a proteina (in kilodaltons) sò mostrati in A è B. (C) L'intensità di u signale radiuattivu (media ± SEM) hè stata determinata da trè esperimenti indipendenti.*P≤0,05.A forza di u signale (percentuale) hè ligata à UTP.
Ancu se l'attività enzimatica in relazione à NiRAN hè stata dimustrata esse essenziale per a replicazione di EAV è SARS-CoV in a cultura cellulare (16), a funzione specifica di NiRAN è i target potenziali ùn sò micca stati ancora determinati.A similitudine strutturale recentemente riportata trà NiRAN è una famiglia di proteini cù pieghe simili à a proteina kinase (17, 22) ci hà incitatu à pruvà l'ipotesi chì NiRAN catalizza a NMPylation di altre proteine.Avemu generatu un inseme di miri omologhi potenziali, cumprese proteine non strutturali codificate da HCoV-229E ORF1a (nsps 5, 7, 8, 9, 10), ognuna chì cuntene un tag His6 C-terminale (appendice SI, Tabella S1), è incubate queste proteine con [α32-P] uridine trifosfato ([α32-P]UTP) in presenza o assenza di nsp12.L'albumina di serum bovina è a proteina di fusione MBP-LacZα prodotta in E. coli anu servitu cum'è cuntrolli (Figura 2A, corsie 1 à 7).A proteina radiolabeled hè stata analizata da l'elettroforesi in gel di sodium dodecyl sulfate-poliacrilamide (SDS-PAGE) è l'autoradiografia, è si trova chì ci era un forte signale radiuattivu in a reazione chì cuntene nsp12 è nsp9.A pusizioni di u signale currisponde à a massa moleculare di nsp9, chì indica l'UMPylation mediata da nsp12 di nsp9 (Figura 2B, pista 7).Nisuna altra proteina di teste hè stata trovata UMPylated, chì ci hà purtatu à cuncludi chì nsp9 hè un sustrato specificu di nsp12.In cunfurmità cù i dati di l'auto-NMPylation mostrati in a Figura 1, nsp12 hè capaci di trasferisce tutti i quattru NMP à nsp9, anche se l'efficienza hè diversa, UMP> adenosina monofosfato (AMP)> guanosina monofosfato (GMP)> cytidine monofosfato (CMP) ) ( Picture).3 A è B).In e cundizioni aduprate in questu analisi (accorta a reazione è u tempu di esposizione, riduce a cuncentrazione di nsp12; materiali è metudi), l'auto-NMPylation di nsp12 ùn pò micca esse rilevata (paragunate Figura 2B, corsia 7 è Figura 1B), chì dimustratu un efficace (È parechje round) UMP spustatu da nsp12 à nsp9.L'attività di transferasi UMP richiede a presenza di ioni Mn2 +, cum'è mostra in a Figura 3C, mentre chì solu l'attività di transferasi UMP minima hè stata osservata in presenza di Mg2 +, è nisuna attività in presenza di l'altri dui cationi divalenti testati.Dati simili sò stati ottenuti in saggi di NMPylation chì cuntenenu cytidine triphosphate (CTP), guanosina trifosfatu (GTP) è adenosina trifosfatu (ATP) (appendice SI, Figura S1).
HCoV-229E nsp12-mediated UMPylation di nsp9.Una serie di substrati di proteina (cumpresa l'albumina di siero bovina, MBP-lacZα, è una serie di nsps HCoV-229E marcati cù His6 C-terminale codificata da ORF1a) sò stati usati per valutà l'attività UMPylation di HCoV-229E nsp12-His6⁺-mediated proteina.Incubare a proteina cù [α-32P] UTP per 10 minuti in assenza (A) o presenza (B) di nsp12 cum'è descritta in i materiali è i metudi.In cima di A è B, u gel SDS-poliacrilamide macchiatu cù Coomassie Brilliant Blue hè mostratu, è in u fondu di A è B, l'autoradiogrammi currispondenti sò mostrati.A pusizione di u marcatore di massa moleculare di a proteina (in kilodaltons) hè datu à a manca.A pusizione di nsp12-His6 (B, cima) è u signale radioattivu osservatu durante l'incubazione di nsp12-His6 cù nsp9-His6 (B, corsia 7) sò ancu indicati, chì indicanu chì [α-32P] UMP à nsp9-His6. (12,9 kDa), chì ùn hè micca osservatu per altre proteini testate.
HCoV-229E Caratterizazione biochimica è virologica mediata da NiRAN di nsp9 NMPylation.(A è B) U rolu di u co-substrat nucleotide utilizatu in a reazione.Nsp12-His6 è nsp9-His6 sò mischiati è incubati in a presenza di diversi [α-32P] NTP in u test standard di NMPylation.(A, cima) Coomassie-stained nsp9-His6 separati da SDS-PAGE.(A, fondu) Autoradiografu di a stessa zona di u gel.(B) L'attività relative (media ± SEM) in presenza di u cofactor nucleotide designatu hè determinata da trè esperimenti indipendenti.*P≤0,05.(C) U rolu di ioni metalli.Hè mostratu u test standard di NMPylation in presenza di [α-32P] UTP è ioni metalli differenti, ognunu cù una cuncentrazione di 1 mM.In C, a cima, Coomassie stained nsp9-His6 hè mostratu, è in C, u fondu, l'autoradiografia currispondente hè mostrata.A dimensione di a proteina marcata (in kilodaltons) hè indicata à a manca di A è C. (D) A forma mutante di HCoV-229E nsp12-His6 chì porta a sostituzione di l'aminoacidu specificata hè in [α-32P] UTP, cum'è descritta. in Materiali è Metudi.A nsp9-His6 radiomarcata prodotta in a reazione di NMPylation hè rilevata da l'imaghjini di fosforilazione (D, cima).L'attività relative paragunata cù a proteina salvatica (wt) hè mostrata in D, è u fondu hè pigliatu cum'è a media (± SEM) da trè esperimenti indipendenti.L'asterischi indicanu sustituzzioni di residui micca cunservati.(E) U titulu di virus in u supernatante di a cultura di e cellule p1 ottenute 24 ore dopu l'infezzione hè stata determinata da u test di placca.I sustituzzioni di codon in u duminiu NiRAN di u mutante HCoV-229E ingegneriatu sò indicati (a numerazione di residue hè basatu annantu à a so pusizioni in pp1ab).U mutante di u situ attivu RdRp nsp12_DD4823 / 4AA hè stata utilizata cum'è cuntrollu.
Per acquistà una cunniscenza più profonda di u situ attivu di NiRAN è determinà i residui ligati à l'attività di a transferasi NMP specifica nsp9, avemu realizatu analisi di mutazione, in quale avemu rimpiazzatu i residui conservatori in i motivi NiRAN AN, BN è CN ( 16) Hè Ala (appendice SI, Figura S2).Inoltre, l'impattu di i sustituzzioni conservatori Arg-to-Lys o Lys-to-Arg hè statu evaluatu in dui casi.Cum'è un cuntrollu (negativu), i residui chì ùn sò micca o menu cunsirvati in u duminiu NiRAN di coronavirus è altri virus nidificatu sò rimpiazzati cù Ala. Sustituitu K4116A (in motif preAN), K4135A (AN), R4178A (BN), D4188A (motivu). BN) è D4280A (CN) riduce significativamente o ancu elimina nsp9 NMPylation attraversu nsp12, mentri i proteini cù sustituzzioni conservatori (R4178K), K4116R) conservanu 60% è 80% di a so attività, chì indicanu chì a rilassazione di e restrizioni da u so latu rispettivu. catene hè fisicochimicamente sensitivu (Figura 3D).A rimpiazzà parechji altri residui conservati E4145A, D4273A, F4281A è D4283A hè assai menu dannusu, è nsp9 UMPylation hè solu moderatu ridutta.I risultati simili sò stati ottenuti in reazzioni di nsp9 NMPylation chì implicanu altri NTP (Figura 3D è appendice SI, Figura S3), cunfirmendu chì l'effetti osservati nantu à i sustituzzioni di l'aminoacidi specifichi sò indipendenti da u tipu di co-substrate nucleotide utilizatu.Dopu, avemu pruvatu l'impattu pussibule di sti sustituzzioni nsp12 nantu à a replicazione di coronavirus in a cultura cellulare.A tal fine, avemu usatu mudelli adattati di DNA cumplementari geneticu (cDNA) clonati in virus vaccinia recombinante (23, 24) per trascrive 5 -7 cellule.A titration di a progenie di virus infettivi pruduciutu in queste cellule hà dimustratu chì a maiò parte di i mutanti HCoV-229E NiRAN ùn eranu fattibili (Figura 3E).Un gruppu di mutanti virali non viable include alternative chì sò stati dimustrati per eliminà o riduce significativamente l'attività di NMP transferase in vitro (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A), ma ci sò duie altre alternative (K4116R, E41045A) % riservatu ?A so attività di NMPylation in vitro suggerisce chì sò implicati restrizioni supplementari.In u listessu modu, duie altre mutazioni (R4178K, F4281A) chì anu causatu una diminuzione moderata di l'attività di NMPylation in vitro di NiRAN anu pruduttu virus vivi, in ogni modu, questi virus anu riduciutu significativamente i titoli per a replicazione.In cunfurmità cù i dati di l'attività in vitro mostrati in a Figura 3D, rimpiazzà quattru altri residui chì ùn sò micca cunservati in coronavirus è / o altri virus nidificati (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16) hà pruduttu virus viabili A prole, malgradu avè avutu. un titre modérément réduit par rapport au virus sauvage (Figure 3E).
Per studià se l'attività di transferase NMP mediata da NiRAN dipende da u duminiu RdRp attivu, i dui residui Asp conservati implicati in a coordinazione di ioni di metalli divalenti (11) in RdRp motif C sò stati rimpiazzati da Ala. A proteina resultanti nsp12_DD4823 / 4AA conserva a so attività di NMPylation nsp9, chì indica chì l'attività di NMPylation nsp9 in vitro nsp9 mediata da nsp12 ùn necessita micca attività di polimerasi (SI Appendix, Figura S4).
Dopu avè stabilitu l'attività di transferasi NMP specifica per nsp9 per nsp12, avemu pruvatu à caratterizà l'adduct NMP-nsp9 per spettrometria di massa (MS).U spettru di massa di a proteina cumpleta di HCoV-229E nsp9 recombinante hà mostratu un piccu à 12,045 Da (Figura 4A).L'aghjunzione di nsp12 ùn hà micca cambiatu a qualità di nsp9, chì indica chì nsp12 è nsp9 ùn formanu micca un cumplessu stabile in e cundizioni utilizati (denaturazione) (Figura 4A).In a presenza di UTP è GTP, a misurazione di massa di a reazione chì cuntene nsp9 è nsp12 rispettivamente hà dimustratu chì a massa di proteina di UTP si moveva 306 Da, è a massa di proteina di GTP si moveva di 345 Da, indicando chì ogni molécula di nsp9 lega un UMP o GMP. (Figura 4) C è D).Hè speculatu chì l'energia necessaria per a NMPylation nsp9 mediata da NiRAN vene da l'idrolisi NTP è a liberazione di pirofosfati.Ancu se un eccessu molare di 10 volte di nsp9 (target) cà nsp12 (enzima) hè statu utilizatu in questa reazione, hè stata osservata una NMPylation quasi completa di nsp9, chì indica chì l'interazzione trà nsp12 è nsp9 hè di corta durata, è nsp12 pò NMPylate più nsp9. molécule in vitro.
NMPylation unica di nsp9 in presenza di nsp12 è UTP o GTP.Hè mostratu u spettru di massa di proteina completa deconvoluted di HCoV-229E nsp9 (appendice SI, Tabella S1) (AD).(A) nsp9 sola, (B) nsp9 + nsp12-His6, (C) nsp9 + nsp12-His6 in presenza di UTP, (D) nsp9 + nsp12-His6 in presenza di GTP.
Per determinà i residui nsp9 UMPylated da nsp12, nsp9-UMP hè stata scissa cù tripsina.I peptidi risultanti sò stati separati da cromatografia liquida nano-high performance (HPLC) è analizati da spettrometria di massa tandem (MS / MS) in linea.L'analisi di dati utilizendu u pacchettu di software Byonic (Protein Metrics) hà dimustratu UMPylation di l'aminoacidu N-terminale.Questu hè cunfirmatu manualmente.U spettru di massa in tandem di u peptide precursore [UMP] NNEIMPGK (Appendice SI, Figura S5A) hà revelatu un frammentu à 421 m / z, chì indica chì UMP si lega à u residuu 1 di nsp9.
À l'estremità N di nsp9, Asn hè cunservatu trà i membri di Orthocoronavirinae (appendice SI, Figura S6).Ancu s'ellu crede chì l'azotu di l'amina primariu N-terminale hè l'accettore più prubabile per UMP, avemu decisu d'ottene evidenza supplementu di u ligame NMP à l'N-terminale.Per questu mutivu, u peptide N-terminale non NMPylated è NMPylated nsp9 purificatu da HPLC hè statu derivatu in presenza di acetone è cianoborohydrure di sodiu.In queste cundizioni, solu l'amine primarie libere ponu esse mudificate cù propyl (25).U peptide derivatu da nsp9 N-terminale cù a sequenza NNEIMPGK cuntene duie amine primarie, una à l'N-terminale di Asn è l'altra à a catena laterale di Lys à u C-terminale.Per quessa, i gruppi propili ponu esse intrudutti à i dui estremità.I cromatogrammi ioni estratti di peptidi non-NMPylated sò mostrati in l'appendice SI, Figura S5B.Cum'è previstu, i peptidi N-terminali è C-terminali (mono)propilati (Appendice SI, Figura S5B, corsia superiore) è peptidi dipropilati (Appendice SI, Figura S5B, corsia inferiore) ponu esse identificati.Stu mudellu cambia cù l'usu di u peptide NMPylated N-terminale di nsp9.In questu casu, solu i peptidi propylati C-terminali ponu esse identificati, ma i peptidi propylati N-terminali è i peptidi dipropylated ùn sò micca identificati (Appendice SI, Figura S5C), chì indicanu chì UMP hè statu trasferitu à l'amina primaria N-terminale Per impediscenu questu. gruppu da fà cambiamenti.
In seguitu, rimpiazzamu (cù Ala o Ser) o sguassate i residui cunservati à u N-terminale di nsp9 per definisce e restrizioni specifiche di destinazione.Basatu nantu à i nostri dati MS chì mostranu chì NiRAN forma un adduct nsp9-NMP cù l'ammina primaria di u residuu N-terminale di nsp9, avemu ipotizatu chì nsp9 NMPylation richiede a proteasi master virale (Mpro, nsp5) per liberà l'nsp9 N-terminal da u so precursore di poliproteina.Per pruvà sta ipotesi, avemu pruduciutu una proteina precursore nsp7-11 chì cuntene nsp9 in E. coli è hà realizatu un test NMPylation standard in a presenza di [α-32P] UTP (materiali è metudi).Comu mostra in a Figura 5A (lane 3), u precursore nsp7-11 uncut ùn hè micca radiomarcatu cù nsp12.In cuntrastu, se nsp7-11 hè cleaved da nsp5 recombinante per liberà nsp9 (è altri nsps) da u precursore, una proteina radiomarcata chì migra cù nsp9 hè rilevata, cunfirmendu a nostra cunclusione chì NiRAN è N-Formazione selettiva di adducts nsp9-NMP covalenti. .L'amina primaria terminale di l'Asn N-terminale (posizione 3825 in pp1a/pp1ab).Questa cunclusione hè ancu sustinuta da esperimenti chì utilizanu a custruzzione nsp9, chì cuntene unu o dui residui supplementari à u N-terminale.In i dui casi, l'UMPylation mediata da NiRAN di nsp9 hè stata abulita (Appendice SI, Figura S7).Dopu, avemu pruduciutu una proteina cù unu o dui residui Asn eliminati da a sequenza di peptide 3825-NNEIMPK-3832 à l'N-terminale di nsp9.In i dui casi, l'UMPylation nsp9 hè stata completamente bluccata (Figura 5B), dendu evidenza supplementaria chì u veru N-terminale nsp9 agisce cum'è un receptore NMP.
U prucessu proteoliticu di nsp9 è u rolu di i residui N-terminali in l'UMPylation mediata da nsp12.(A) nsp9 UMPylation richiede un N-terminale nsp9 gratuito.Nsp7-11-His6 hè pre-incubata à 30 ° C in un buffer di rilevazione di NMPylation chì cuntene UTP in presenza o assenza di Mpro ricombinante (nsp5-His6).Dopu à 3 ore, principià l'assay di NMPylation aghjustendu nsp12-His6 cum'è deskrittu in Materiali è Metodi.A reazione chì cuntene nsp5-His6 (lane 1) è nsp9-His6 (lane 2) hè stata aduprata cum'è cuntrollu.Dopu à 10 minuti, a reazione hè stata terminata è a mistura di reazzione hè stata separata da SDS-PAGE.A proteina hè stata macchiata cù Coomassie Brilliant Blue (A, cima).U precursore Nsp7-11-His6 è u pruduttu trasfurmatu risultatu da a clivatura mediata da nsp5-His6 sò mostrati à a diritta.Per piacè nutate (per via di a so piccula dimensione) chì nsp7 è nsp11-His6 ùn sò micca rilevabili in questu gel, è a reazione hè supplimentata cù nsp5-His6 (carrieri 1 è 4; a pusizione di nsp5-His6 hè indicata da un cercolu solidu) o nsp9-His6 (Lane 2) cuntene una piccula quantità di MBP (indicata da i circles aperti) cum'è impurità residuali perchè sò espressi cum'è proteine di fusione MBP (appendice SI, Table S1).(B) A variante Nsp9-His6 manca unu o dui residui Asn N-terminali (numerazione di residui secondu a pusizione in pp1a / pp1ab) è hè purificata è incubata cù nsp12-His6 è [α-32P] UTP.B, SDS-PAGE macchiatu cù Coomassie hè mostratu in cima, B, l'autoradiografu currispundente hè mostratu in fondu.A pusizione di u marcatu di pesu moleculare (in kilodaltons) hè indicata à a manca.(C) HCoV-229E nsp9-His6 N-terminale residui cunservati sò stati rimpiazzati cù Ala o Ser, è a stessa quantità di proteina hè stata aduprata in a reazione UMPylation mediata da nsp12-His6.I prudutti di reazione sò stati separati da SDS-PAGE è macchiati cù Coomassie Brilliant Blue (C, in cima), è nsp9-His6 radiolabeled hè statu rilevatu da l'imaghjini di fosforescenza (C, mediu).Utilizendu a proteina salvatica (wt) cum'è riferimentu (set à 100%), l'attività NMPylation relative (media ± SEM) hè stata calculata da trè esperimenti indipendenti.(D) Titoli di virus in u supernatante di cultura di cellule p1 di cellule Huh-7 infettate da cellule Huh-7 di tipu salvaticu HCoV-229E, è mutanti chì portanu sostituzioni d'aminoacidi designati in nsp9 sò stati determinati da un test di placca.U mutivu RdRp C doppiu mutante DD4823 / 4AA di replicazione deficiente hè stata utilizata cum'è cuntrollu negativu.
U N-terminale di nsp9 (in particulare i pusizioni 1, 2, 3 è 6) hè assai cunservatu trà i membri di a subfamiglia Orthocoronavirinae (appendice SI, Figura S6).Per studià u rolu pussibule di questi residui in nsp9 NMPylation mediata da nsp12, dui residui Asn consecutivi à l'N-terminale di nsp9 sò stati rimpiazzati cù Ala o Ser (solu o in cumminazione).Comparatu cù nsp9 di tipu salvaticu, rimpiazzà N3825 cù Ala o Ser hà risultatu in più di una riduzzione doppia in UMPylation mediata da nsp12 (Figura 5C).In cunfurmità cù a nostra cunclusione chì NMPylation si trova in l'amina primaria N-terminale invece di a catena laterale di u residu N-terminale, avemu osservatu NMPylation residuale significativu cù a sustituzione di N3825A è N3825S.Curiosamente, se u sicondu Asn hè rimpiazzatu da Ala o Ser, nsp9 UMPylation hè ridutta più forte (più di 10 volte), mentre chì a sustituzione di Ala in i pusizioni 3, 4 è 6 hà solu un effettu moderatu nantu à nsp9 UMPylation (Figura 2). ).5C).I risultati simili sò stati ottenuti cù ATP, CTP o GTP (appendice SI, Figura S8).Cullittivamenti, sti dati indicanu u rolu chjave di N2826 (posizione 2 in nsp9) in nsp9 NMPylation.
Per ottene evidenza supplementu di a correlazione funzionale trà l'N-terminale di nsp9 è NMPylation, avemu realizatu un allineamentu di sequenza multipla (MSA) di a sequenza nsp9 di a famiglia di Coronavirus (variendu trà 104 è 113 residui) (Appendice SI, Figura). S6).In totale, in 47 spezie (cunnisciute è putative) di 5 generi di a sottofamiglia Orthocoronavirinae chì infettanu diversi mammiferi, uccelli è hôtes di rettili, solu 8 residui in totale sò stati trovati invarianti.I cambiamenti più estensi, cumprese eliminazioni è inserimenti, sò stati osservati in i ciculi trà l'elementi di a struttura secundaria di nsp9, cum'è determinatu da studii strutturali previ (26 ?? 28).Cinque résidus invariants ont été trouvés dans le brin β et l'hélice α de la partie C-terminale de nsp9.Trè residui invarianti custituiscenu u mutivu NNE di u N terminus di nsp9.Hè revelatu chì u sicondu Asn di stu mutivu hè l'unicu residuu invariante, chì hè ancu spartutu da l'ipoteticu nsp9 di u coronavirus di rana distanti, è rapprisenta a spezia Microhyla letovirus 1 in a sottofamiglia Letovirinae di Alphaletovirus.A cunservazione di i residui in l'elementi di a struttura secundaria nsp9 pò esse raziunalizata da considerazioni strutturali per mantene e proprietà di plegamentu o cunnisciute di l'RNA.Tuttavia, stu ragiunamentu ùn pare micca applicà à a cunservazione di NNE, è prima di stu studiu, a natura di e restrizioni chì limitanu a variazione di a sequenza di tripeptide hè stata completamente oscurata.
Per determinà l'impurtanza di nsp9-NMPylation è a conservazione di NNE in a replicazione di coronavirus, avemu pruduciutu mutanti HCoV-229E, chì portanu sostituzioni singole o doppie di residui nsp9 N-terminali, chì indicanu chì a NMPylation nsp9 hè dannosa in vitro.Prima di principià, pruvemu di risponde à a quistione se sti sustituzzioni (vicinu à u situ di clivaggio nsp8 | 9) affettanu u processamentu proteoliticu di a regione C-terminal pp1a.Un settore di nsp7-11 polyprotein custruzzioni chì cuntenenu sustituzzioni currispundenti à u N-terminale di nsp9 sò stati pruduciutu in E. coli è tagliatu cù Mpro recombinante.A clivatura proteolitica di i quattru siti (cumpresu u situ flanking nsp9) ùn hè micca significativamente affettata da qualsiasi sustituzioni introdutte (appendice SI, Figura S9), escludendu cambiamenti strutturali in sti proteini chì interferiscenu cù u clivage nsp8 | 9 mediatu da Mpro (O altri) situ web.
E cellule Huh-7 sò state trasfettate cù RNA HCoV-229E di lunghezza di genoma, codificante Ala o Ser sustituzioni in i tripeptidi NNE conservati (N3825, N3826 è E3827) à l'estremità N nsp9, chì mostra chì a maiò parte di e mutazioni sò fatali.Pudemu salvà u virus rimpiazzendu u Ser o Ala di l'Asn N-terminale (N2835A o N2835S), ma ùn hà micca riesciutu à ricuperà u virus cù altre mutazioni singuli è doppie in a sequenza NNE (N3826A, N3826S, NN3825/6AA, NN3825/6SS) , E3827A) (Figura 5D).
Questi risultati indicanu chì a replicazione di coronavirus in a cultura tissutale hè limitata (stessa o simile), limitendu a mutazione naturale di i siti di NMPylation nsp9 in u corpu, è sustene u rolu chjave di sta risposta in u ciculu di vita di coronavirus.
In l'ultimu gruppu di esperimenti, avemu pruduciutu C-terminal His6 marcatu SARS-CoV-2 nsp12 è nsp9, è duie forme mutanti di nsp12 in E. coli.I residui di u situ attivu in i duminii NiRAN è RdRp eranu rispettivamente Use Ala invece (Figura 6A è appendice SI, Table S2).K4465 in SARS-CoV-2 nsp12 currisponde à K4135 in HCoV-229E (Appendice SI, Figura S2), chì si dimustrava esse necessariu per l'attività NiRAN è a replicazione di HCoV-229E (Figura 3D è E).Stu residuu currisponde ancu à u residuu di u virus arterial EAV nsp9 K94, chì era prima dimustratu per esse necessariu per l'auto-UMPylation / self-GMPylation NiRAN (16).Cum'è mostra in a Figura 6B, SARS-CoV-2 nsp12 hà attività di transferasi UMP utilizendu nsp9 cum'è sustrato, mentre chì u mutante di u situ attivu nsp12_K4465A hè inattivu.A doppia sustituzione in a sequenza caratteristica SDD di RdRp motif C ùn affetta micca l'attività di transferasi UMP (Figura 6B), chì indica chì l'attività RdRp ùn hà micca effettu direttu in nsp9 UMPylation.Dati simili sò stati ottenuti cù CTP, GTP è ATP (appendice SI, Figura S10).In riassuntu, sti dati indicanu chì a NMPylation nsp9 mediata da NiRAN hà una attività conservativa in coronavirus chì rapprisentanu diversi generi di a sottofamiglia di ortocoronavirus.
NMPylation mediata da SARS-CoV-2 nsp12 di nsp9.(A) Gel SDS-poliacrilamide macchiato da Coomassie che mostra a proteina ricombinante usata in a prova di NMPylation.Comu cuntrollu, hè stata utilizata una proteina mutante cù a sostituzione di u situ attivu in u duminiu NiRAN (K4465A) è RdRp (DD5152/3AA) di SARS-CoV-2 nsp12.A numerazione di u residuu hè basatu annantu à a pusizione in pp1ab.(B) Autoradiografu di a rilevazione di UMPylation utilizendu nsp9-His6 è [α-32P] UTP cum'è sustrato di nsp12-His6 (tipu salvaticu [wt] è mutante).A massa moleculare (in kilodaltons) di a proteina marcata hè mostrata à a manca.
I domini NiRAN sò generalmente cunservati in Nidovirales (16), chì indicanu chì catalizzanu reazzioni enzimatici essenziali per a replicazione di Nidovirus.In questu studiu, avemu statu capace di dimustrà chì u duminiu NiRAN di u coronavirus trasferisce NMP (generatu da NTP) à nsp9, una misteriosa proteina di legame di RNA implicata in a replicazione di virus (26 ?? 29), per determinà cum'è un mira naturali è partner di coronavirus RTC.
U duminiu NiRAN sparte trè mutivi di sequenza (AN, BN, è CN), chì cuntenenu un numeru assai chjucu di residui chì sò cunsirvati in tutte e famiglie in l'ordine di Nidovirales monophyletic ma assai differenziatu (8, 16).Studi recenti anu dimustratu chì sò strutturalmente ligati à una famiglia largamente micca carattarizatu di proteini protein kinase-like, chì sò stati urigginariamenti chjamati a famiglia SelO (17, 19, 22, 30, 31).E proteine selO-related anu pieghe kinase, ma mancanu parechji residui di u situ attivu cunservatu in kinases classic (22, 32).Basatu annantu à l'orientazione inversa di e molécule ATP ligati à u situ attivu è stabilizatu da interazzioni specifiche, SelO hè statu ipotizatu è successivamente cunfirmatu per trasferisce AMP (invece di fosfatu) à u sustrato di a proteina (22), mentre chì una altra proteina bacteriana simile à SelO YdiU hà. recentemente hè statu dimustratu per catalizà l'attaccamentu covalente di UMP à Tyr è i residui di His di diversi substrati di prutezione (33).
Per cunfirmà è espansione a prediczione di i residui di u situ attivu putativu di u duminiu coronavirus NiRAN, avemu utilizatu metudi biochimichi è di genetica inversa per realizà analisi di mutazione nantu à u coronavirus nsp12 (Figura 3D è E è appendice SI, Figura S3 è tabella) S1â S4).I dati mostranu chì a rimpiazzamentu di HCoV-229E K4135, R4178 è D4280 cù Ala elimina l'attività di NMP transferasi in vitro è a replicazione di virus in a cultura cellulare (Figura 3D è appendici E è SI, Figura S3), sustenendu a so presenza in NTP γ-phosphate. (K4135, R4178) è a coordinazione di ioni metalli di u situ attivu (D4280).La substitution E4145A du Glu conservé dans l'intervalle du virus du nid d'oiseau prévu pour stabiliser la position K4135 (17) a été montrée pour éliminer la réplication virale, mais étonnamment, l'activité a été retenue dans l'essai de NMPylation in vitro (Figure 3D et E et appendice SI, figura S3 è tabelle S1-S4).Una osservazione simili hè stata fatta quandu a sustituzione currispondente hè stata introdutta in l'omologu YdiU di Salmonella typhimurium (E130A) (33).Pigliate inseme, sti dati sustenenu a funzione regulatoria di stu residuu conservatu piuttostu cà a funzione catalitica.
A sostituzione di u residuu Phe conservatu (F4281A) in a gamma di nestovirus in u duminiu HCoV-229E NiRAN (8) hà risultatu in una diminuzione di l'attività di NMPylation in vitro è una diminuzione significativa di a replicazione di virus in a cultura cellulare (Figura 3D, E è SI) appendice, Figura S3).I dati sò coerenti cù l'impurtante funzione regulatoria di stu residuu, cum'è u residuu omologu DFG motif Phe mostratu prima.In a proteina kinases classica, hè parti di u ciclu di ubligatoriu Mg2 + è aiuta à assemblà è regulà a spina???Ubligatoriu per una attività catalitica efficace (32, 34).Sustituendu Ala è Arg per i residui K4116 (in u mutivu preAN), rispettivamente, hà eliminatu a replicazione virali è, cum'è previstu, hà avutu effetti diffirenti nantu à l'attività di NMP transferasi in vitro, secondu a catena laterale di l'aminoacidu introdotta (Figura 3D è E è appendici SI). , Figura S3).I dati funziunali sò cunsistenti cù l'infurmazioni strutturali, chì indicanu chì stu residuu hà stabilitu una interazzione cù ATP fosfatatu (17).In u duminiu NiRAN di altre famiglie di virus nidificate, a pusizione di HCoV-229E pp1a / pp1ab K4116 hè occupata da Lys, Arg o His (8), chì indicanu chì a restrizione funzionale di stu residuu specificu hè stata rilassata.A sustituzione di D4188A è D4283A elimina o riduce fermamente l'attività enzimatica è elimina a replicazione di virus (Figura 3).Questi dui residui sò cunservati in a maiò parte (ma micca in tutti) virus nidificatu (8), chì indicanu una funzione impurtante specifica di a famiglia, ma possibbilmente non catalitica.Sustituzioni Ala di parechji altri residui di Lys è Asp (K4113A, D4180A, D4197A è D4273A) chì ùn sò micca cunservati in i Coronaviridae o altre famiglie di Nestioviridae (8) sò stati usati cum'è cuntrolli.Comu aspittatu, sti sustituzzioni sò largamente tolerate, cù una ligera diminuzione di l'attività enzimatica è a replicazione virali in certi casi (Figura 3 è appendice SI, Figura S3).In generale, i dati di mutagenesi di coronavirus sò assai coerenti cù l'auto-GMP è i dati di genetica inversa di EAV NiRAN-RdRp (16), in quale EAV nsp9 (coronavirus nsp12 ortholog) residue K94 (corrispondente à HCoV-229E K4135) funzioni impurtanti), R124 (currispondente à R4178), D132 (currispondente à D4188), D165 (currispondente à D4280), F166 (currispondente à F4281).Inoltre, i dati di mutagenesi HCoV-229E sò coerenti è espansi da i dati di genetica inversa SARS-CoV riportati prima (16), cum'è assai simili à quelli osservati per u mutante CN Phe-to-Ala currispondente SARS-CoV_nsp12 fenotipu descrittu -F219A è HCoV-229E_F4281A (Figura 3 D è E è appendice SI, Figura S3 è Table S1-S4).
In cunfrontu cù l'ortologi EAV (16), chì anu una preferenza clara per UTP è GTP (in a reazione d'auto-NMPylation), u nostru studiu mostra chì u duminiu coronavirus NiRAN (rappresentatu da HCoV-229E è SARS-CoV-2) pò esse efficace. trasferitu Tutti i quattru NMP, ancu s'ellu ci hè una ligera preferenza per UMP (Figure 1 è 3).A specificità relativamente bassa di u co-substrat NTP specificu hè coherente cù a struttura supercomposita SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 riportata recentemente, in quale ADP-Mg2+ si lega à u situ attivu di NiRAN, ma micca cù adenine Part. di a furmazione di interazzione specifichi (17).In u nostru studiu, u tipu di nucleotide utilizatu in a reazione di NMPylation ùn hà micca un effettu differenziale nantu à l'attività di a proteina mutante (SI Appendix, Figura S3), chì indica chì nimu di sti residui sò strettamente ligati à u ligame di una nucleobase specifica.A basa strutturale è u putenziale significatu biologicu di e diverse preferenze di co-substrate NTP osservate in i domini NiRAN di coronavirus è virus arteriali restanu da studià;ponu esse veru o pò esse dovutu à e limitazioni di i so studii rispettivi.Attualmente, ùn si pò micca escluditu chì l'attività potenziale NMPylator di u duminiu NiRAN di virus arteriale (rispettu à l'attività d'auto-NMPylation precedentemente carattarizzata) hà una preferenza di co-substratu sfarente, tenendu in contu chì a similitudine trà l'arteriale è u coronavirus. U duminiu NiRAN hè à u so limitu.Comparare basatu in sequenza (16).In cunfrontu cù a pseudokinase SelO, chì usa Mg2 + cum'è cofattore, l'attività di coronavirus è virus arteriale NiRAN hè dipendente da Mn2 + (16) (Figura 3C è appendice SI, Figura S1).A dipendenza da Mn2 + è l'evidente preferenza per l'UTP hè una caratteristica inusual di i proteini NMPylators, è hè stata cunfirmata solu recentemente in a proteina YdiU di Salmonella typhimurium, chì catalizza a stretta proteina dipendente da Mn2 + UMPylation per prutegge e cellule da l'induzione di stress Cell ATP pool ( 33).
A somiglianza strutturale descritta recentemente trà u duminiu di coronavirus NiRAN è i protein kinases cellulari (17, 19) furnisce un supportu supplementu per a capacità di NiRAN di ligà in modu covalente NMP à altre proteine chì avemu infurmatu in stu studiu.Avemu cuncentratu a nostra ricerca di pussibuli target NiRAN nantu à e proteine codificate da HCoV-229E ORF1a, chì sò cunnisciute per assiste direttamente o indirettamente a replicase codificata in ORF1b di RTC (12, 35).I nostri esperimenti furniscenu evidenza conclusiva per a NMPylation efficace è specifica di nsp9 (Figura 2).Se a proteina di destinazione hè aduprata in un eccessu molare chì hè 8 à 10 volte più altu ch'è quellu di l'enzima (nsp12), hè cunfirmatu chì nsp9 hè cumpletamente (mono) NMPized (Figura 4).Avemu cunclusu chì l'interazzione trà nsp12 è nsp9 hè di corta durata è ùn formarà micca un cumplessu stabile cù nsp9 (in assenza di altre subunità RTC).Questa cunclusione hè sustinuta da studii d'interazione di proteine in u proteoma SARS-CoV (35).L'analisi MS identificava l'amina primaria di u residuu N-terminale di nsp9 cum'è u situ di NMPylation (Appendice SI, Figura S5).A furmazione di u legame fosforamidatu è u gruppu amminicu N-terminale distingue l'attività di NMPylation mediata da NiRAN da a reazione di AMPylation mediata da SelO di Pseudomonas syringae, chì catalizza a furmazione di AMP O-linked in Ser, Thr, o Tyr residues Peptide adduct ( 22), è S. typhimurium YdiU forma O-linked (cù Tyr) è N-linked (cù His) peptide-UMP adducts.L'infurmazione limitata dispunibile nantu à a famiglia di proteine SelO indica chì i membri di questa grande famiglia di proteine differiscenu assai in a furmazione di l'adducts peptide-NMP.Il s'agit d'une observation intéressante qui mérite d'être étudiée plus loin.
I dati ottenuti in stu studiu ci anu purtatu à l'ipotesi chì a NMPylation di nsp9 richiede un N-terminale liberu.In u cuntestu di a replicazione virali, questu serà furnitu da a clivatura proteolitica di u situ di trasfurmazioni nsp8|nsp9 in a poliproteina replicase pp1a mediata da Mpro è pp1ab.In a maiò parte di i coronavirus, a diffarenza trà stu situ specificu (VKLQ | NNEI in HCoV-229E) è tutti l'altri siti di scissioni di coronavirus Mpro hè Asn (piuttostu cà un altru residuu chjucu, cum'è Ala, Ser Or Gly) occupanu P1â???Locu (36).I dati di scissione di peptide ottenuti in i primi studii anu dimustratu chì l'efficienza di scissione di u situ nsp8|nsp9 era più bassu di quellu di l'altri siti, chì indicanu chì 1) stu situ specificu pò avè un rolu regulatori in u prucessu coordinatu puntuale di u C-terminal. regione pp1a, o 2) a U rolu di u nsp9 N-terminale speciale cunservatu in a replicazione di virus (37).I nostri dati (Figura 5A) anu dimustratu chì a forma recombinante di nsp9 chì porta a sequenza N-terminale reale hè stata NMPizzata in modu efficace da nsp12.A sequenza di flanking N-terminale hè stata eliminata da u fattore Xa (nsp9-His6; appendice SI, Table S1) o clivatura mediata da Mpro (nsp7-11-His6; Figura 5A è appendice SI, Table S1).Impurtante, u precursore nsp7-11-His6 uncut chì cuntene nsp9 hà dimustratu resistenza à NMPylation di nsp12, chì hè coherente cù i nostri dati, chì indicanu chì l'adduct nsp9-NMP hè furmatu da l'amina primaria N-terminale (Appendice SI, Figura S5) .Per acquistà una cunniscenza più profonda di a specificità di u sustrato NiRAN, ci focalizemu dopu nantu à i residui N-terminali adiacenti di nsp9.In l'absenza di altre proteini, sò strutturalmente flessibili, impediscendu di esse rilevati in a forma senza etichetta di nsp9 (26 28, 38), chì indicanu a so variazione naturali limitata. funzione di u fragmentu N-terminale nsp9.Sustituzioni Ala di residui cunservati in questa regione (Figure 5C è D è appendice SI, Figura S8) rivelanu chì N3826 hè essenziale per a NMPylation nsp9 in vitro, mentre chì e sostituzioni N3825A è E3827A portanu à una diminuzione di NMPylation, mentre chì e sostituzioni M3829A è P3830A ùn anu micca. .Ovviamente affettanu nsp9 NMPylation.Ancu se a sostituzione di Asn N-terminale (N3825A, N3825S) hà solu un effettu moderatu nantu à a NMPylation nsp9 è a replicazione di virus in a cultura cellulare (Figura 5C è D), l'eliminazione di una sequenza di residu di Asn da u dipeptide N-terminale 3825-NN. dimustratu à esse Hè letale à i virus, chì indicanu chì un residuu Asn hè necessariu prima di un altru residuu à u N-terminale, preferibilmente Asn, ancu s'ellu pare chì a sustituzione di residui simili pò esse tolleratu parzialmente (Figura 5B, C, è D).Concludemu chì u dipeptide 3825-NN, in particulare u residuu N3826 cunservatu è essenziale in a gamma di coronavirus (appendice SI, Figura S6), assicura a legame è l'orientazione curretta di u nsp9 N-terminale in u situ attivu di NiRAN.
A sostituzione di Ala (E3827A) per u Glu cunservatu di tutte e sottofamiglie conserva nsp9 NMPylation in vitro ma hè letale per i virus in a cultura cellulare (Figura 5C è D), chì indica a funzione supplementaria di stu residuu, per esempiu, in interazzione chjave (NMPylated o unmodified). ) nsp9 N-terminale è altri fattori implicati in a replicazione di virus.E mutazioni Nsp9 ùn anu micca affettatu u prucessu proteoliticu di nsp9 o qualsiasi nsps adiacenti (39) (Appendice SI, Figura S9), chì indicanu chì i fenotipi letali di parechje mutazioni nsp9 osservate ùn sò micca causati da a disregulazione di l'area PP1a di u prucessu proteoliticu C. .
I dati di sopra furnisce evidenza chì dopu à u trattamentu Mpro-mediated di u situ di clivage nsp8 | 9 in pp1a / pp1ab, u N-terminale di nsp9 pò esse UMPylated (o parzialmente mudificatu cù un altru NMP).Inoltre, l'eccellente conservazione di u N-terminale di nsp9 (cumpresi i residui Asn singulari è invarianti in a famiglia di coronavirus) è i dati di genetica inversa ottenuti in stu studiu (Figure 3E è 5D) ci anu purtatu à cuncludi chì a NMPylation nsp9 descritta. hè biologicamente ligatu è essenziale per a replicazione di coronavirus.E cunsequenze funziunali di sta mudificazione restanu da studià, per esempiu, in quantu à l'attività di ubligatoriu di l'RNA (2628) nsp9 (non-specifica) descritta prima (forma non modificata).NMPylation N-terminale pò ancu influenzà l'interazzione di nsp9 cù sustrati di proteine o RNA o a furmazione di diverse assemblee di quattru livelli.Quessi sò stati osservati in studii strutturali è sò stati cunfirmati per esse funziunali ligati à a replicazione di coronavirus, anche se soprattuttu in l'absenza di In u casu di sta mudificazione (26- ââ29, 40).
Ancu se a specificità di destinazione di u duminiu coronavirus NiRAN deve esse carattarizatu in più dettagliu, i nostri dati mostranu chì a specificità di destinazione di a proteina di u duminiu coronavirus NiRAN hè assai stretta.Ancu se a cunservazione di i residui di u situ attivu chjave (8, 16) in u duminiu NiRAN di tutte e famiglie di nidovirus sustene fermamente l'attività di l'NMPylator conservati sti proteini, l'identità di i residui di sacchetta di u sustrato di u sustrato di stu duminiu A conservazione è a conservazione restanu da esse carattarizata. , è pò differisce trà e diverse famiglie di scopi Nidovirales.In listessu modu, i miri pertinenti di l'altri virus nidificati anu ancu esse determinati.Puderanu esse ortologi remoti di nsp9 o altre proteine, perchè e sequenze fora di i cinque duminii replicasi chì sò generalmente cunservati in virus nidificati sò menu cunservati (8), cumprese l'array di genoma trà Mpro è NiRAN, trà elli, nsp9 hè situatu in u corona virus.
Inoltre, ùn pudemu micca escludiri attualmente a pussibilità chì u duminiu NiRAN hà miri supplementari (inclusi cellulari).In questu casu, vale a pena nutà chì l'omologu bacterial in questa proteina emergente NMPylators (NMPylators) (30, 31) pare avè "regulatori maestri"?NMP modula una varietà di proteine cellulari per regulà o eliminà e so attività downstream, ghjucanu cusì un rolu in una varietà di prucessi biologichi, cum'è a risposta di stress cellulare è l'omeostasi redox (22, 33).
In questu studiu (Figure 2 è 4 è SI Appendice, Figure S3 è S5), avemu statu capace di dimustrà chì nsp12 trasfirìu a parte UMP (NMP) à una pusizioni unica (conservata) in nsp9, mentri àutri proteini ùn sò micca mudificate in u utilizatu Sutta e cundizioni, a specificità di sustrato ben definita (piuttostu chè solta) hè supportata.In cunfurmità cù questu, cumparatu cù NMPylation nsp9 N-terminale, l'attività di NMPylation propria di nsp12 hè assai bassa, a so rilevazione richiede un tempu di esposizione autoradiografia più longu, è un aumentu di 10 volte in a cuncentrazione di nsp12 hè utilizatu.Inoltre, a nostra analisi MS hà fallutu per furnisce evidenza per NMPylation di nsp12, chì suggerisce chì l'auto-NMPylation di u duminiu NiRAN hè (in u megliu) una attività secundaria.Tuttavia, deve esse nutatu chì altri studii anu furnitu evidenza preliminare chì u statutu d'auto-AMPylation di NMPylator bacterial pò cuntrullà a so attività di NMPylation nantu à altri sustrati di proteina (22, 33).Dunque, più ricerca hè necessaria per investigà i pussibuli effetti funzionali di l'attività di auto-NMPylation riportate per EAV nsp9 (16) è coronavirus nsp12 (stu studiu), cumpresu l'effettu di chaperone prupostu nantu à u plegamentu di u duminiu RdRp C-terminale ( 16) ).
Prima, parechje ipotesi in quantu à e pussibuli funzioni downstream di u duminiu NiRAN nidoviral sò state cunsiderate, cumprese RNA ligase, RNA-capped guanylate transferase è attività di priming di proteina (16), ma nimu d'elli sò cumpatibili cù e funzioni downstream dispunibili.L'infurmazione ottenuta in e pusizioni seguenti hè esattamente u stessu tempu senza fà supposizioni supplementari.I dati ottenuti in stu studiu sò più coherente cù (ma ùn pò micca pruvucà) chì u duminiu NiRAN hè implicatu in l'iniziu di a sintesi di RNA indotta da a proteina.Prima era cridutu chì a funzione di u duminiu NiRAN in 5 ??²-RNA capping o riazzioni ligation RNA ùn hè micca affettatu da questi è Supportu di altri dati.Dunque, per esempiu, u situ attivu di NiRAN hè cunsideratu cum'è l'Asp conservatu cum'è una basa generale (D252 in Pseudomonas syringae SelO; D4271 in HCoV-229E pp1ab; D208 in SARS-CoV-2 nsp12) (Appendice SI, figura 2). ).S2) (17, 22, 33), mentre chì a catalisi in l'RNA ligase dipendente da ATP è l'enzima capping RNA hè realizata da l'enzima covalente-(lysyl-N)-NMP intermediate, chì implica un residuu Lys non cambiatu ( 41).Inoltre, a specificità rimarchevule basata in sequenza di u coronavirus NiRAN per i target di proteine conservate è a specificità rilassata per i co-substrati NTP (preferisce UTP) si oppone à l'enzima di capping mediata da NiRAN o funzioni simili à RNA ligase.
Ovviamente, assai travagliu extra hè necessariu per verificà è, se pruvucatu, elaburà nantu à u pussibile rolu di nsp9-UMP (nsp9-NMP) in a sintesi di RNA indotta da a proteina, chì cunnette parechji rapporti interessanti ma (finu à avà) rappurtati prima. .Osservazioni isolate.Per esempiu, hè statu determinatu chì a fine di l'RNA negativu di u coronavirus principia cù un filu oligo (U) (42, 43).Questa osservazione hè coherente cù l'idea chì a sintesi di l'RNA di filamentu negativu hè iniziata da u ligame di a forma UMPylated di nsp9 à a coda di poli (A) (triggers), chì pò esse promossa da a so legame à l'ARN L'attività è / o interazzione cù altra proteina RTC.A parte UMP furnita da nsp9 pò esse aduprata cum'è "primer" per l'oligouridilazione mediata da nsp7/8/nsp12, utilizendu a coda 3??²-poly (A) in l'RNA genomicu o una altra sequenza contenente oligo (A) serve cum'è mudellu, simile à u mecanismu stabilitu per a proteina picornavirus VPg (44).E se a pruposta hè "non-normativa"????L'iniziu di a sintesi di RNA negativu (indotta da proteine) furnisce un ligame à l'osservazioni, chì indicanu chì l'RNA di filamentu negativu di coronavirus hà UMP (invece di UTP) à a so fine (42), chì hè cunsideratu per indicà chì u l'acidu nucleicu Dicer scinde l'estremità fosforilata da una endonucleasi uridina-specifica scunnisciuta.Se cunfirmatu, sta attività idrolitica di l'acidu nucleicu pò aiutà à liberà a forma oligomerica UMPylated di nsp9 da l'estremità 5 ² di u filu negativu nascente.U pussibile rolu di nsp9 in l'iniziu di a proteina hè ancu coherente cù studii di genetica inversa precedente, chì anu dimustratu chì nsp9 (è nsp8) interagisce in modu criticu è specificamente cù l'elementu RNA chì agisce in cis cunservatu vicinu à l'estremità 3 di u genoma di coronavirus.45).Sicondu stu rapportu, sti osservazioni precedenti ponu avà esse esaminati è espansi per più ricerche.
In riassuntu, i nostri dati anu determinatu l'attività specifica di un tag di enzima di virus nidificatu propiu ligatu à RdRp à l'N-terminale.In coronavirus, sta attività di UMPylator / NMPylator mediata da NiRAN di novu scuperta hè aduprata per appughjà nantu à Mn2 + è residui Asn adiacenti è pruvucà a furmazione di legami fosforamidate (di bassa energia) cù l'amina primaria N-terminale.Attraversu a clivatura mediata da Mpro in u situ di clivaggio nsp8 | 9, u target nsp9 pò esse usatu per NMPylation, chì indica l'accoppiamentu funzionale trà a proteasi è u duminiu NiRAN, chì si estende à RdRp.A cunservazione di i residui chjave in u situ attivu nsp12 NiRAN è u target nsp9, cumminata cù dati ottenuti da dui coronavirus, cumpresu SARS-CoV-2, furnisce una forte evidenza chì nsp9 NMPylation hè un coronavirus E caratteristiche conservative sò ancu un passu chjave in a replicazione di virus.I dati dispunibili ci portanu à cuncludi chì u rolu specificu di a forma NMPylated di nsp9 in a sintesi di RNA indotta da a proteina hè un scenariu raghjone per coronavirus è altri virus nidificati, è NiRAN pò ancu mira à altre proteine non identificate.Regulà u virus.Interazione di l'ospite.Se cunfirmatu, l'implicazione di i primeri di proteine in a sintesi di RNA virali aumenterà l'affinità di sequenza di i domini Mpro/3CLpro è RdRp trà u coronavirus precedentemente rilevatu è u supergruppu simili à picornavirus (9), chì sò stati unificati in i Pisonivirites recentemente stabiliti (9). 46) in a categuria.
I nostri dati mostranu ancu chì l'attività enzimatica basica, selettiva è cunsirvativa identificata in stu studiu pò esse usata cum'è mira di droghe antivirali.I cumposti chì interferiscenu cù u ligame (è a modificazione successiva) di u nsp9 N-terminale cunservatu in u situ attivu di NiRAN ponu esse sviluppati in droghe antivirali efficaci è versatili, adattati per u trattamentu di coronavirus animali è umani da diverse (sub)genus Infezioni. , cumpresu SARS-CoV-2 è Coronavirus Sindrome Respiratoriu di u Mediu Oriente.
A sequenza di codificazione di a proteina coronavirus prodotta in stu studiu hè stata amplificata da RT-PCR utilizendu RNA isolatu da Huh-7 infettatu cù HCoV-229E o Vero E6 infettatu cù SARS-CoV-2, è inseritu cù e prucedure standard di clonazione.pMAL-c2 (New England Biological Laboratory) o pASK3-Ub-CHis6 (47) vettore d'espressione (SI Appendix, Tables S1 è S2).Sustituzioni di codon unicu sò state introdutte da mutagenesi diretta à u situ basata in PCR (48).Per pruduce a proteina di fusione MBP, e cellule di E. coli TB1 sò stati trasfurmati cù a custruzzione di plasmidi pMAL-c2 appropritatu (appendice SI, Table S1).A proteina di fusione hè stata purificata da a cromatografia di affinità di amilosa è clivata cù u fattore Xa.In seguitu, a proteina C-terminale His6-tagged hè stata purificata da cromatografia di affinità di metalli immobilizzati Ni (Ni-IMAC) cum'è descritta prima (49).Per pruduce a proteina di fusione di ubiquitin, e cellule di E. coli TB1 anu utilizatu u plasmidiu pASK3-Ub-CHis6 appropritatu (Appendice SI, Tabelle S1 è S2) è u DNA plasmidicu pCGI codificante l'idrolasi C-terminale specificu di ubiquitina 1 (Ubp1).Trasfurmà (47).A proteina di coronavirus C-terminale His6-tagged hè stata purificata cum'è descritta prima (50).
A prova di auto-NMPylation di HCoV-229E nsp12-His6 hè stata realizata cum'è descritta in EAV nsp9 (16).In breve, nsp12-His6 (0,5 µM) contiene 50 mM di acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetansulfonic (HEPES)-KOH, pH 8,0, 5 mM ditiotreitolo (DTT), 6 mM MnCl2, 25 µM di tampone incubato l'NTP specificata è 0,17 µM currispondenu à [α32-P]NTP (3.000 Ci/mmol; Hartmann Analytic) à 30 ° C per 30 minuti.In tutti l'altri saggi di NMPylation (standard) di NMPylation nsp9 mediata da nsp12, e cundizioni di reazione sò adattate cume: nsp12-His6 (0,05 µM) è nsp9-His6 (4 µM) in presenza di 50 mM HEPES-KOH (pH 8,0). ), 5 mM DTT, 1 mM MnCl2, 25 µM indicato NTP e 0,17 µM corrispondente [α32-P]NTP.Dopo l'incubazione per 10 minuti a 30 °C, il campione di reazione è stato miscelato con tampone di campionamento SDS-PAGE: 62,5 mM tris(idrossimetil)aminometano HCl (pH 6,8), 100 mM DTT, 2,5% SDS, 10% glicerolo e 0,005% bromofenolo. turchinu.A proteina hè stata denaturata da u calore à 90 ° C per 5 minuti è siparata da 12% SDS-PAGE.U gel hè fissatu è macchiatu cù a suluzione Coomassie Brilliant Blue (40% metanol, 10% àcitu aceticu, 0.05% Coomassie Brilliant Blue R-250), decolorized, è esposta à una schermu di imaging fosforescente per 20 ore (per detect nsp12 da NMPylation) o (massimu) 2 Hours (per valutà nsp9 NMPylation).Un imager Typhoon 9200 (GE Healthcare) hè statu utilizatu per scansà u screnu è ImageJ hè stata utilizata per analizà l'intensità di u signale.
Per l'analisi MS, 1 µM nsp12-His6 è 10 µM nsp9 (senza tag di hexahistidine) sò stati utilizati in l'analisi NMPylation (appendice SI, Tabella S1) è a concentrazione aumentata di 500 µM UTP è GTP sò stati utilizati.Sicondu a so cuncentrazione è a qualità di a proteina prevista, un sistema HPLC Waters ACQUITY H-Class equipatu di una colonna MassPrep (Waters) hè stata utilizata per desalà da 1 à 10 µL di solu suluzione di proteina tamponata in linea.A proteina desalata hè eluita in a fonte di ioni elettrospray di u spettrometru di massa Synapt G2Si (Waters) attraversu u gradiente seguente di buffer A (acqua / 0,05% àcitu formicu) è tampone B (acetonitrile / 0,045% acidu formicu), è a temperatura di a colonna hè. 60 ° C è un flussu di 0,1 mL / min: eluzione isocraticamente cù 5% A per 2 minuti, dopu un gradiente lineare à 95% B in 8 minuti, è mantene 95% B per altri 4 minuti.
Ioni pusitivi cù una gamma di massa da 500 à 5000 m/z sò rilevati.Glu-fibrinopeptide B hè misuratu ogni 45 seconde per a correzione automatica di a deriva di massa.Aduprate u software di strumenti MassLynx cù l'estensione MaxEnt1 per deconvolve u spettru mediu dopu a deduzzione di a linea di basa è u lisciamentu.
UMPylated HCoV-229E nsp9 hè statu digeritu aghjunghjendu tripsina modificata di qualità di sequenza (Serva) è incubatu durante a notte à 37 ° C.Una colonna di spin Chromabond C18WP (numero di parte 730522; Macherey-Nagel) hè stata aduprata per desalà è cuncentrazione di i peptidi.Infine, u peptide hè dissolutu in 25 µL d'acqua, chì cuntene 5% acetonitrile è 0,1% àcitu formicu.
I campioni sò stati analizati da MS utilizendu un spettrometru di massa Orbitrap Velos Pro (Thermo Scientific).L'ultimu sistema nanoâ HPLC (Dionex), dotatu di un 50 cm persunalizatu à l'estremità ??Colonna 75 μm C18 RP imballata cù perle magnetiche 2.4 μm (Dr. Albin Maisch High Performance LC GmbH) Cunnettete à u spettrometru di massa in linea attraversu a fonte nanospray Proxeon;iniettare 6 µL di soluzione di digestione con tripsina in un diametro interno di 300 µm ×??1 cm C18 PepMap colonna di pre-concentrazione (Thermo Scientific).Utilizendu acqua / 0,05% di l'acidu formicu cum'è solvente, a mostra hè stata automaticamente intrappulata è desalinata à un flussu di 6 µL/min.
I gradienti seguenti di acqua / 0,05% àcitu formicu (solvent A) è 80% acetonitrile / 0,045% acid formic (solvent B) sò stati usati per ottene a separazione di peptidi triptichi à un flussu di 300 nL / min: 4% B per 5 minuti, poi 30 A gradiente lineale à 45% B in minuti, è un aumentu lineale à 95% solvent B in 5 minuti.Cunnette a colonna cromatografica à un nano-emitter d'acciaio inox (Proxeon), è spruzzate l'eluent direttamente à u capillare riscaldatu di u spettrometru di massa utilizendu un potenziale di 2 300 V. A scansione di l'indagine cù una risoluzione di 60 000 in l'analizzatore di massa Orbitrap hè assuciata. cù almenu trè scans MS / MS di dati, escluduti dinamicamente per 30 seconde, utilizendu a dissociazione indotta da una trappola ionica lineare o una dissociazione di collisione di energia più alta cumminata cù a rilevazione di orbitrap, A risoluzione hè 7,500.
Tempu di Postu: Aug-03-2021